珊瑚来源群体淬灭活性产生菌的筛选与抑菌活性(3)

1.3.2 群体淬灭活性菌株的筛选

紫色杆菌CV具备显著的群体感应现象[27]，共附生菌株会抑制紫色菌素的分泌，产生透明圈，具备该现象的菌株即为群体淬灭活性菌株。实验中考虑到紫色杆菌CV在液体培养基中难以把控存活周期及紫色菌素分泌量，故利用固体培养基对群体淬灭活性菌株进行筛选。

操作步骤：将群体淬灭活性筛选培养基划分16格打孔，取200 μL 1.3.1节分离培养的菌株发酵液置于孔内培养初筛，以产生透明抑菌圈为阳性菌株[26]。牛津杯均匀排布在2.0%琼脂固体培养基平板上，倒入群体淬灭活性筛选培养基，制成四孔双层群体淬灭活性验证平板。待平板凝固后，每个孔加入200 μL阳性菌株发酵液，30℃培养48 h，观察结果。

1.4 16S rDNA序列分析

使用16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGGY-TACCTTGTATACGACTT-3′)对群体淬灭活性菌株的基因片段进行PCR扩增[28]。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30个循环。琼脂糖凝胶电泳验证条带后,将PCR产物送深圳华大基因股份有限公司进行基因测序，测定序列通过GenBank数据库进行比对鉴定。

1.5 菌株发酵和活性物质提取

取群体淬灭活性菌株各100 μL置于10 mL MA培养基中，恒温过夜振荡培养至培养液的OD600为1，即得纯化培养后的菌株发酵液。发酵液于8 000 r/min离心5 min取上清液，用0.22 μm有机滤膜过滤，除菌保存，获得无菌阳性菌株的发酵液上清，即为含有群体淬灭活性物质的溶液。

1.6 群体淬灭活性物质对珊瑚病原菌V545和Z-14生长的影响

以比浊法测定海洋病原菌生长曲线[30,31]。微生物生长曲线是描述微生物生长状况的基本指标[32]。比浊法测定生长量的原理是以细菌悬浮液的生物量与悬浮液的混浊程度成正比为基础，利用紫外可见分光光度计测定OD600，间接推断样品中微生物总量[33]。

操作步骤：将病原菌V545和Z-14接种到MA液体培养基中，恒温过夜振荡培养至OD600为1，即为病原菌液。取2 mL无菌阳性菌株发酵液上清与10 mL MA液体培养基混合，接种1%病原菌液。以12 mL MA接种1%病原菌液为空白对照。25℃，160 r/min振荡培养，每隔一定时间测定OD600并记录。至菌株生长进入衰弱期时停止培养，以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线。

1.7 群体淬灭活性物质对珊瑚病原菌V545和Z-14运动性的影响

弧菌具有极性鞭毛，可在液体环境中游动，并可在半固态表面上显示出运动性[34]，本实验采用半固体培养基法分析病原菌运动性[35]。

操作步骤：将珊瑚病原菌V545和Z-14分别接种至MA培养基中，恒温过夜振荡培养至OD600为1。以MA液体培养基∶菌液=100∶1的比例稀释珊瑚病原菌发酵液，将稀释后的珊瑚病原菌发酵液与无菌阳性菌株发酵液上清按1∶1的比例混合，取0.5 μL接种于LB固体培养基平板；将稀释后的珊瑚病原菌发酵液与MA液体培养基1∶1混合，取0.5 μL作为空白对照，每株菌种平行点样3个；室温静置过夜培养，记录菌团直径(mm)。

1.8 群体淬灭活性物质对珊瑚病原菌V545和Z-14生物被膜生成的影响

采用96孔微量板法[36]并参考文献[36-38]的实验方法进行一定改动。采用1.7节培养的珊瑚病原菌V545和Z-14，然后用MA/2液体培养基(浓度为MA液体培养基的一半)将病原菌发酵液稀释至OD600为0.05。取100 μL稀释后的病原菌发酵液和100 μL无菌阳性菌株发酵液上清混合，加入96孔聚苯乙烯微培养板，每孔200 μL。另外取100 μL稀释后的病原菌发酵液与100 μL MA培养基混合，作为空白对照，每孔200 μL。每组设置3个平行实验。

将微孔板室温放置24 h后，孔壁上附着一层厚度均匀的薄膜(生物被膜)，小心除去培养液，以一级水浸洗微孔板，风干后用1%结晶紫染色20 min。待染色完全后，以一级水浸微孔洗板并风干，再加入200 μL无水乙醇充分溶解，用酶标仪测定OD570，取3个复孔均值。

2 结果与分析

2.1 珊瑚共附生菌株的分离与群体淬灭活性

本研究通过蔗糖密度梯度离心法和原位模拟培养法，共从7类不同珊瑚的样品中分离出256株共附生菌种(未鉴定物种)。如图1为蔗糖密度梯度离心法稀释样品后，在原位模拟环境下培养出的角珊瑚共附生菌菌落。

图1 原位模拟培养平板Fig.1 In-situ simulation culture plate

紫色杆菌 CV具备显著的群体感应现象[2]，本研究通过判断其紫色菌素的分泌，筛选出群体淬灭活性菌株。由图2可见，鹿角珊瑚中分离培养出的共附生菌株周围产生透明圈，且仍可见密集无色的紫色杆菌菌落，说明该菌为具群体淬灭活性的阳性菌株。同样原理，从256株共附生菌种中初步筛选出20株具备潜在群体淬灭活性的菌株。

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