珊瑚来源群体淬灭活性产生菌的筛选与抑菌活性(2)

三亚珊瑚岸礁是我国岸礁最为发育的地点之一，鹿回头岸段一直是我国开展珊瑚礁研究和保护管理的代表地区[23]，该地区珊瑚及其共附生微生物物种丰富度高，是热带海洋中最突出的代表性生态系统之一[24]。虽然近年来鹿回头地区珊瑚面临着多重威胁，珊瑚覆盖率从以前的80%—90%下降到如今的21.83%，但已有相关研究表明，这种情况主要是人类活动影响和全球气候变化所导致的[25]，而该地区极少有关于珊瑚疾病的研究及报道[7]，由此推测，该地区可能存在群体淬灭活性菌。

紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)是一类具QS效应的革兰氏阴性细菌，当自身细胞密度达到一定临界浓度时，会向环境释放信号分子C6-HSL与特定转录调节蛋白结合，调控紫色素相关基因的表达[26]，产生紫色素用以指示QS作用的产生。目前作为一种简便、直观的QS抑制因子筛选模型[27]，被广泛应用于各类细菌的QS研究中。本项目选取三亚鹿回头7类珊瑚样品为研究对象，以紫色杆菌为指示菌，筛选出具有较高群体淬灭活性的珊瑚共附生菌株，运用16S rDNA测序分析并结合GenBank数据库进行种属鉴定，研究其对海洋致病菌溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌的生长、运动性和生物被膜生成的影响，为防治病原细菌群体感应引起的珊瑚白化提供新材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

从三亚市鹿回头半岛三亚湾(109°28′E,18°13′N)采集覆盖度高的、具有代表性的珊瑚样品，包括鹿角珊瑚(Acroporaaustera)、鹿角杯型珊瑚(Pocilloporadamicornis)、扁脑珊瑚(Platygyrasp.)、片状蔷薇(Turgescenssp.)、滨珊瑚(Poritessp.)、盾形陀螺(Scleractinlasp.)及角蜂巢(Favitessp.)等7类珊瑚。每类珊瑚采集3个样品，每个样品剪碎后装入10 mL海水，振荡仪振荡后，保存于4℃备用。

1.1.2 主要试剂

胰蛋白胨粉末(LP0042)、酵母粉末、技术琼脂粉末(Agar Powder)购自广东环凯微生物科技有限公司；葡萄糖粉购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钠、柠檬酸铁购自天津市大茂化学试剂厂；宿主弧菌溶珊瑚弧菌、溶藻弧菌购自国家海洋局第三研究所海洋微生物保藏中心；紫色杆菌CV 购自美国微生物保藏中心；2×Taq Mastermix购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Glycine、TRIS、SDS购自北京索莱宝科技有限公司；胶回收试剂盒、DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 培养基配制

Marine Agar (MA)培养基(g/L)：胰蛋白胨5.0，酵母提取粉1.0，葡萄糖0.5，柠檬酸铁0.1，海水定容，pH值为 7.2—7.5。

MA固体培养基：在MA培养基的基础上，加入10.0 g/L琼脂，海水定容。

珊瑚内环境原位模拟培养基[28]：0.22 μm有机过滤膜过滤珊瑚组织匀浆，去除细菌，制备无细胞珊瑚组织液(CFCF)。以CFCF∶MA固体培养基=1∶10体积比例配制模拟珊瑚内环境的营养固体培养基。

2.0%琼脂固体培养基：琼脂20.0 g/L，海水定容。

Luria-Bertani (LB)培养基(g/L)：胰蛋白胨5.0，酵母提取粉1.0，氯化钠10.0，双蒸水定容，pH值为7.4。

LB固体培养基：在LB培养基的基础上，加入10.0 g/L琼脂。

群体淬灭活性筛选培养基：融化的40℃ LB固体培养基200 mL，加入紫色杆菌CV发酵液200 μL混匀。

1.2 珊瑚共附生微生物的分离培养

1.2.1 菌体收集

参考文献[28]的方法：称取1 g含骨骼、黏液及珊瑚组织的珊瑚样品碎块，同一种珊瑚样品称取3份，分别用无菌海水浸泡在15 mL收集管中，1 920 r/min转速下漩涡振动15 min，获得浓稠的珊瑚组织匀浆，放置在4℃冰箱内短时间保存。

1.2.2 原位模拟培养

蔗糖密度梯度离心是将珊瑚组织匀浆中不同类属的微生物分层的有效方法，大大提高珊瑚共附生微生物的存活率，获得更多种类的可培微生物。参考文献[29]的蔗糖密度梯度离心方法：在1.5 mL EP管中依次加入0.3 mL 40%、30%、20%、10%梯度浓度的蔗糖溶液；移液枪取0.4 mL各珊瑚组织匀浆0.5 μm过滤膜过滤液，移入EP管溶液上层，低速离心；以0.4 mL为1个级分，用移液枪定量移取不同级分离心液至EP管，用无菌海水稀释至3个浓度(10-1、10-2、10-3)；取200 μL稀释10-3倍后的不同级分菌液，在珊瑚内环境原位模拟固体培养基上涂布，常温培养24 h。

1.3 群体淬灭活性产生菌的筛选

1.3.1 单菌落分离纯化

从1.2.2节培养的平板中挑出不同单菌落，在MA固体培养基平板上划线，纯化培养出单一菌落，再接种到10 mL MA液体培养基内，160 r/min 25℃条件下扩大培养。

文章来源：《运动精品》 网址: http://www.ydjpzz.cn/qikandaodu/2021/0523/1790.html