合浦珠母贝幼虫变态中的形态、器官变化及运动(6)

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图版Ⅰ 不同日龄幼虫形态特征PlateⅠ Morphological characteristics at different days post hatching1. 1日龄幼虫; 2. 4日龄幼虫; 3. 7日龄幼虫; 4. 10日龄幼虫; 5. 13日龄幼虫; 6. 16日龄幼虫; 7. 19日龄幼虫; 8. 22日龄幼虫; 9. 25日龄幼虫; 10. 28日龄幼虫; 11. 31日龄幼虫; 12. 稚贝1. 1 dph larvae; 2. 4 dph larvae; 3. 7 dph larvae; 4. 10 dph larvae; 5. 13 dph larvae; 6. 16 dph larvae; 7. 19 dph larvae; 8. 22 dph larvae; 9. 25 dph larvae; 10. 28 dph larvae; 11. 31 dph larvae;

图版Ⅱ 合浦珠母贝幼虫运动状态PlateⅡ The moving states ofPinctada fucatalarvae1. 幼虫在水中运动状态俯视图; 2. 幼虫在水中运动状态侧面观示意图; 3. 变态幼虫; 4. 幼虫在水面运动状态俯视图; 5. 幼虫在水面运动状态侧面观示意图; 6. 变态幼虫运动状态； Vel. 面盘; Cil. 纤毛; Fro. 前端; Bac. 后端; Umb. 壳顶; Foo. 斧足; Gil. 鳃1. The top view of larvae moving in the water; 2. The side view of larvae moving in the water; 3. Metamorphosed larvae; 4. The top view of larvae state on the surface of the water; 5. The side view of larvae moving on the surface of the water; 6. The metamorphosed larvae moving state in the water vel： velum; Cil： cilia; Fro： front; Bac： back; Umb： umbo; Foo： foot; Gil： gill

图版 Ⅲ 幼虫与稚贝摄食状态Plate Ⅲ Ingestion status ofP. fucatalarvae and juvenile1. 合浦珠母贝幼虫; 2. 合浦珠母贝稚贝; Cil. 纤毛; Vel. 面盘; Fro. 前端; Int. 肠; Sto. 胃; Bac. 后端; Gar. 鳃弓; Gfd. 鳃丝间距; Gfi. 鳃丝;Foo. 斧足1.P. fucatalarvae; 2.P. fucatajuvenile; Cil. cilia; Vel. velum; Fro. front; Int. intestines; Sto. stomach; Bac. back; Gar. gill arch; Gfd. gill filament distance; Gfi. gill filament; Foo. foot

合浦珠母贝(Pinctada fucata), 又称马氏珠母贝(Pinctada martensii), 自然分布于热带和亚热带区域, 是培育海水珍珠的重要母贝之一[1,2]。因其相较于大珠母贝(Pinctada maxima)、珠母贝(Pinctada margaritifera)和企鹅珍珠贝(Pteria penguin)三种大型珍珠贝有着较强的抗逆性、育珠周期短及适宜在中国南海大规模养殖等特点, 合浦珠母贝的珍珠养殖也已成为广东、广西和海南等部分沿海地区支柱性产业之一[3,4]。由此, 合浦珠母贝也早已在遗传育种[5]、苗种繁育[6]、养殖管理[7]、插核育珠、珍珠加工[8]、贝壳及贝肉开发利用[9,10]等领域形成了一条完整的产业链, 其基础研究也早已涵盖形态学分析[11]、摄食生理[12]、分子生物学[13]等各方面。在海洋贝类的养殖生产中, 苗种繁育技术仍然是制约其大规模养殖的关键因素之一。虽自1965年合浦珠母贝就已成功突破人工苗种繁育[14],但幼虫培育后期至变态过程中死亡率较高, 幼虫培育技术水平极不稳定。目前, 合浦珠母贝苗种供应还主要依赖于提供大量亲贝及个体自身较大的排卵量(一次性排卵量为百万级)。以个体间杂交手段, 大规模构建家系的选育方法, 其成功率仍然没有保证。在其他海洋双壳贝类幼虫培育中, 有人试图通过调节幼虫培育密度[15,16], 饵料种类筛选[17,18],调节饵料投喂浓度及比例搭配[19—23], 分析饵料营养价值和幼虫营养需求[24—28], 改进苗种培育设施[29]及理化因子等手段, 来提高幼虫培育成活率和生长速率。但就目前来看, 许多贝类幼虫培育过程中其成活率依然较低, 初始幼虫成功变态至稚贝的比例不及0.1%甚至更低[30,31], 幼虫培育技术仍然是限制某些海洋贝类实现规模化生产的重要因素。异速生长机制普遍存在于生物生长模式中, 它可以描述生物体某一部分相对生长速率与另外一部分相对生长速率或不同属性之间的联系[32]。即某些对生存能力有显著提升的初生器官相对于整体而言表现为快速生长, 当该器官协调身体各部分的需要后, 则逐渐转变为等速生长或慢速生长, 从而在特定环境中以最小的能量供应获得最优的生存能力[32]。本实验利用光学显微镜观察比较了合浦珠母贝幼虫在生长、变态过程中其形态、器官变化, 观察幼虫和稚贝运动与摄食过程。通过对合浦珠母贝幼虫生长及变态过程中形态、器官的变化及异速生长进行研究, 从而了解某些形态特征及器官优先发育所行使的功能重要性, 揭示幼虫生长及变态过程中的形态变化及内部器官改变的内在规律。有助于从形态学和行为学上掌握合浦珠母贝幼虫在生长发育及变态过程中的生物学信息, 以期为合浦珠母贝苗种培育技术提出改进理念和新思路。1 材料与方法1.1 实验材料合浦珠母贝亲贝[壳长： (62.) mm,n=30]为本课题组在海南省陵水县的新村港(18°25′N,109°58′E)贝架养殖的20月龄贝, 球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)藻种均为本课题组在实验室用5 L的锥形瓶保种, 实验地点位于海南三亚 饵料培养与幼虫培育实验用单胞藻是在顶部直径为90 cm、底部直径为80 cm、高为74 cm的玻璃钢纤维桶内添加F/2营养液[33]于自然光照条件下一次性培养。单胞藻在投喂时应处于指数生长期且球等鞭金藻和小球藻浓度大于106个/mL、亚心形扁藻浓度大于105个/mL。合浦珠母贝亲贝从海区运回后, 清除其表面附着物并涮洗干净, 于阴凉处阴干刺激3h, 待亲贝双壳张开, 挑选性腺饱满的个体, 以雌雄比为3:1左右转移至水泥池中进行流水刺激使其自然排卵授精。受精卵经过大约24h发育至D-形幼虫, 停气30min使幼虫上浮, 虹吸法从上层吸出幼虫并用400目筛绢网过滤清洗, 再转移至水泥池中以5个/mL的密度培养。幼虫培育期间每天8：00和18：00投喂球等鞭金藻, 投喂量从前期的1×103个/mL逐渐增加至5×103个/mL; 变态附着后改投喂小球藻和亚心形扁藻混合藻, 投喂量依稚贝摄食情况作相应调整。幼虫与稚贝培育期间换水量从前期每天的20%逐渐增加到50%, 培育期间水温(24.)℃、盐度34.、pH 7. 幼虫形态、器官变化及运动与摄食观察在幼虫培育的1 dph (days post hatching, 孵化后天数)、4 dph、7 dph、10 dph、13 dph、16 dph、19 dph、22 dph、25 dph、28 dph和31 dph, 分别从培育池中取一部分幼虫观察其形态、器官变化, 在显微镜下连接800万像素摄像头借助Toup View 3.7软件拍照并分别测量其壳长、壳高和绞合线长(n=30)。在培育的31—60 dph每隔3天取稚贝观察其形态变化并分别测量其壳长、鳃丝长(第一片鳃丝基部至末端的距离)、鳃丝间距(第一和第二片鳃丝末端的距离)和鳃丝数量(每片鳃的鳃丝数)。合浦珠母贝幼虫阶段, 把幼虫(含103个/mL级的球等鞭金藻)滴入到0.1 mL (2 cm×2 cm×250 μm)浮游植物计数框中, 盖上盖玻片, 用phenix-ph 100显微镜在物镜40倍镜下观察幼虫摄食过程。幼虫附着变态至稚贝时, 取稚贝放入规格为内径3 cm、高2 cm的胚胎皿中, 滴入藻液在显微镜下观察稚贝摄食过程。合浦珠母贝幼虫以大约5个/mL的密度取5 mL放入胚胎皿中, 显微镜下观察幼虫在水中的运动状态; 在胚胎皿中每次加入20个左右的稚贝并加入5 mL海水在显微镜下观察稚贝正常运动状?图像处理与数据分析用Adobe Photoshop CS5对图像进行处理; 用Auto CAD 2016绘制幼虫运动状态示意图; 实验数据以“平均值±标准差”(±SD)表示, 用Origin 9.1 对数据进行非线性回归参数拟合及作图。幼虫壳长、壳高、绞合线长分别与日龄的指数拟合函数关系可用y=A1e-x/t1+y0表示, 其中,x为幼虫日龄,y为相应日龄幼虫所对应的壳长、壳高和绞合线长,A1、t1和y0为常数。对函数方程式求导, 其中, 函数一阶导用=-A1/t1e-x/t1表示, 当＞0时表示随着日龄的增加其壳长、壳高和绞合线长为正增长, 当＜0时则为负增长; 函数二阶导用表示, 当＞0时表示随着日龄的增加其壳长、壳高和绞合线长为加速增长, 相反当＜0时则表现为减速增长。幼虫以及稚贝的异速生长模型可以用幂函数y=a xb来构建, 其中,x为幼虫或稚贝的壳长,a为在y轴上的截距,b为异速生长指数; 当b等于1时,表现为等速生长, 当b小于1时, 表现为慢速生长, 当b大于1时, 则表现为快速生长[32]。2 结果2.1 幼虫、稚贝的形态和器官变化幼虫生长过程中其形态特征变化如图版Ⅰ所示, 1 dph时(图版Ⅰ-1)为D-形幼虫, 此时幼虫壳扁平、透明、形状呈大写的英文字母“D”。双壳闭合时其壳的前后端几乎完全相同, 形态学壳的前端和后端难以分辨, 绞合线平直且长。随着幼虫生长,平直的绞合线逐渐变短突起成为壳顶, 当幼虫达到13 dph时[壳长(129.) μm,n=30](图版Ⅰ-5),幼虫壳顶突出明显, 壳的前后端发育不同步, 形态学前端较尖而后端则较圆滑。幼虫至31 dph时(图版Ⅰ-11), 部分幼虫进入变态期, 此时幼虫内部器官和外部形态均发生较大改变, 其中, 靠近壳后端的面盘逐渐退化形成鳃, 靠近壳的前端则生成斧足。变态时, 外观上各部分并非同步生长, 此时初生壳[壳长(234.) μm,n=10]停止生长, 在初生壳基础上长出次生壳。初生壳与次生壳间有着明显的界线, 初生壳表面可见呈同心生长的环, 而次生壳表面则由不规则排列的多边形组成, 且次生壳增长速率异常快。幼虫在完全变态至稚贝时, 形态特征如图版Ⅰ-12所示, 此时稚贝形态和结构与成贝基本相同, 功能上也较为完善。不同日龄幼虫其壳长、壳高和绞合线长的均值(n=30)分别与日龄间的拟合方程均存在极显著(P＜0.01)关系。其中, 壳长与日龄关系的拟合结果见图 1A, 拟合指数函数方程为y=.6570ex/.,R2=0.9916, 则有=4.5286ex/.6823、=/.6823,x∈[1, 31]dph区间,和始终满足＞0、＞0, 表明幼虫从初始壳长的(72.) μm至变态时的(221.) μm生长方式为加速正增长。壳高与日龄关系拟合结果见图 1B, 拟合指数函数方程为y= -/109.7627+606.9304,R2=0.9940, 则有=/109.7627、= -/109.7627,x∈[1, 31] dph区间,和始终满足＞0、＜0, 表明幼虫从初始壳高(60.) μm至变态时(197.) μm生长方式为减速正增长。绞合线长与日龄关系拟合结果见图 1C, 拟合指数函数方程为y=/14.8383+1.4657,R2=0.9822, 则有=-/14.8383、=/14.8383,x∈[1, 31] dph区间,和始终满足＜0、＞0, 表明幼虫从初始绞合线长的(49.) μm至变态时的(8.) μm生长方式为加速负增长。不同日龄幼虫的壳高、绞合线长分别与其壳长间均存在极显著(P＜0.01)关系。其中, 壳高与壳长间关系见图 2A, 拟合方程式为y=,R2=0.9843, 可见b=1.0067＞1, 故壳高相对于壳长的生长表现为快速生长。绞合线长与壳长间关系见图 2B, 拟合方程式为y=x-1.5182,R2=0.8338,b=-1.5182＜1, 故绞合线长相对于壳长的生长表现为慢速生长。图 1 不同日龄幼虫形态性状与日龄关系Fig. 1 The correlation between morphological traits and days post hatching 不同日龄幼虫壳长变化; B. 不同日龄幼虫壳高变化; C. 不同日龄幼虫绞合线变化A. Shell length changes of different ages larvae; B. Shell height changes of different ages larvae; C. Hinge length changes of different ages larvae合浦珠母贝31—60 dph的稚贝(壳长450.13—2191.46 μm,n=80)壳长分别与鳃丝长、鳃丝间距及鳃丝数量间均表现为极显著(P＜0.01)相关, 鳃丝长和鳃丝数量与壳长间均表现为正相关, 而鳃丝间距与壳长间则表现为负相关。其中, 鳃丝长与壳长间的关系见图 3A, 拟合方程式为y=,R2=0.5917,b=0.6028＜1, 表明鳃丝长相对于壳长的生长表现为慢速生长。鳃丝间距与壳长间关系见图 3B, 拟合方程式为y=,R2=0.2070,b= -0.1384＜1, 鳃丝间距相对于壳长不仅表现为慢速生长而且随着壳长的增加, 鳃丝间距从66.71 μm逐渐减小到41.90 μm。每片鳃的鳃丝数量与壳长间的关系见图3C, 拟合方程式为y=,R2=0.9097,b=0.9258＜1, 鳃丝数量随着稚贝的生长从5条增至28条, 但相对于壳长的生长其鳃丝数量表现为慢速生 幼虫、稚贝运动与摄食观察图 2 幼虫异速生长曲线Fig. 2 Allometric growth curve 壳高异速生长曲线; B. 绞合线长异速生长曲线A. Allometric growth curve of shell height; B. Allometric growth curve of hinge length幼虫在变态附着前于水中呈浮游状态, 在显微镜下观察到幼虫于水中正常运动时的俯视观状态如图版Ⅱ-1, 其侧面观示意图如图版Ⅱ-2。运动时其双壳张开, 开口朝上壳顶朝下, 面盘伸出壳外呈椭圆形且靠近壳的后端与水平方向呈大概45度角。在运动过程中, 依靠位于面盘外周的纤毛不断摆动从而使面盘产生斜向上的牵引力, 牵引力分解为水平方向上的力和垂直向上的力。水平方向的力用于牵引幼虫在水平方向上的运动, 垂直向上的力用于克服幼虫自身重力使幼虫维持悬浮和升降。俯视观幼虫沿顺时针方向绕不规则圆周运动,当垂直向上的力大于幼虫自身重力与浮力的合力时, 幼虫在水平运动的同时还在向上运动, 此时幼虫的运动状态表现为螺旋上升; 同理当向上的力小于幼虫自身重力与浮力的合力时, 在垂直方向上下降, 幼虫表现为螺旋下降。部分幼虫运动上升至水体表面时, 俯视观状态如图版Ⅱ-4, 其侧面观示意图如图版Ⅱ-5。此时幼虫面盘正面朝上, 所产生的牵引力垂直向上, 幼虫在水体表面运动状态表现为绕自身顺时针方向转动; 当幼虫面盘收缩, 双壳关闭时, 幼虫瞬间垂直下降沉入水中。当幼虫生长发育至变态时[壳长(209.) μm,n=30], 其外观如图版Ⅱ-3所示, 幼虫面盘正逐渐退化而发育成鳃,在靠近壳的前端则生成斧足。在变态过程中, 幼虫运动方式也由悬浮于水中的浮游状态转变为沉入底部的匍匐爬行。幼虫爬行状态如图版Ⅱ-6所示,爬行时双壳张开斧足伸出壳外(图版Ⅱ-3), 靠斧足末端吸附在壁上, 此时幼虫开口朝下壳顶朝上, 通过斧足收缩带动身体向前爬行, 依靠斧足的往复伸长、吸附、收缩来完成幼虫的前行。待幼虫完成变态后, 稚贝不能完全竖立起来, 只能以平躺的姿势在依靠斧足的往复伸长、吸附和收缩来完成爬行。图 3 稚贝鳃异速生长曲线Fig. 3 Allometric growth curve of gill 鳃丝长异速曲线; B. 鳃丝间距异速曲线; C. 腮丝数量异速曲线A. Allometric growth curve of gill filament length; B. Allometric growth curve of gill filament distance; C. Allometric growth curve of gill filament number显微镜物镜40倍镜下在浮游植物计数框中观察到幼虫于水中的摄食状态如图版 III-1, 幼虫在正常的运动过程中也伴随着不断地摄食。幼虫通过面盘外周纤毛不断摆动从而维持自身运动并形成水流, 单胞藻随着水流方向运动, 一部分被幼虫口沟纤毛捕获而进入幼虫口沟, 再通过口沟纤毛摆动把单胞藻带入到胃。胃内绒毛的摆动使单胞藻快速转动并伴随着裂解和消化, 消化的单胞藻在胃自身收缩和绒毛摆动下排入到肠, 再从肛门排出体外,从而完成对单胞藻的摄食、消化和排泄过程。幼虫在完成变态至稚贝的摄食状态如图版 III-2所示,稚贝的滤食器官主要为鳃, 稚贝在正常滤食过程中,双壳张开, 依靠外缘纤毛的摆动从而形成水流, 单胞藻在水流的带动下经过鳃, 在鳃丝鳃小片的摆动下又从鳃丝末端带到鳃丝基部, 尔后单胞藻再沿着鳃弓输送到口瓣从而完成对单胞藻的摄食。3 讨论在合浦珠母贝幼虫生长发育至完成变态过程中, 其外部形态一直发生着改变。伴随着幼虫的生长, 外部形态由“D”形幼虫期平直且长的绞合线逐渐变短突起形成壳顶, 壳的前后端也由几乎完全相同发育至不同, 其形态特征变化与珠母贝幼虫[30]、黄边糙鸟蛤幼虫(Trachycardium flavum)[34]及葡萄牙牡蛎幼虫(Crassostrea angulata)[35]等海洋双壳贝类幼虫相似。在幼虫生长过程中, 各形态性状生长均不同步, 其中, 壳长的生长表现为加速正增长, 壳高表现为减速正增长, 绞合线长则表现为加速负增长。在对幼虫的形态性状作异速生长分析中发现,壳高相对于壳长的生长表现为快速生长, 而绞合线长则表现为慢速生长, 表明幼虫在生长过程中其外部形态一直在发生改变。幼虫生长至壳长为(209.) μm时, 内部器官发生改变, 面盘退化而逐渐形成鳃, 靠近壳的前端则形成了斧足。幼虫壳长至(234.) μm时, 次生壳开始形成, 外观形态上逐渐向成贝转变。幼虫至稚贝阶段的壳始终透明, 但其组成成分及表观发生改变, Miyazaki等[36]利用扫描电镜观察不同阶段幼虫的壳, 发现随着幼虫的生长其壳由原来薄的棱柱层至壳顶期逐渐增加了无定形的碳酸钙。初生壳表面有同心生长的环, 而次生壳表面则由不规则排列的多边形组成。鳃是滤食性贝类稚贝以及成贝重要的呼吸器官和滤食器官[37], 其鳃丝长度、鳃丝数量和鳃丝间距与其滤水面积和滤食效率有着至关重要的作用。在对稚贝壳长分别与鳃丝长、鳃丝间距及鳃丝数量间作异速生长分析发现, 其鳃丝长、鳃丝间距和鳃丝数量相对于壳长的生长均表现为慢速生长。Herbing[38]认为某些对生存能力有显著提升的初生器官相对于整体而言表现为快速生长, 当该器官协调身体各部分需要后, 逐渐转变为等速生长或慢速生长, 从而在特定的环境中以最小的能量供应获得最优的生存能力[39]。对合浦珠母贝稚贝而言,其鳃丝长、鳃丝数量和鳃丝间距均表现为慢速生长, 稚贝鳃的形成在滤食功能上相比于幼虫大大提升, 表明鳃的出现已能充分满足协调身体各部分需要。幼虫与稚贝自身形态结构特征决定其运动、摄食状态, 合浦珠母贝幼虫与其他海洋双壳贝类幼虫一样, 其运动动力源于面盘外周纤毛的摆动[30,34,40],由纤毛摆动维持幼虫运动并完成摄食过程。幼虫在水中正常运动时, 双壳张开, 面盘伸出壳外且靠近壳的后端, 壳顶较重致使壳顶朝下、开壳朝上,面盘斜向上与水平方向呈大概45度角, 纤毛不断摆动使面盘产生斜向上的牵引力。斜向上的牵引力分解为水平方向的力和垂直向上的力, 水平方向的力牵引幼虫于水平方向上运动, 垂直向上的力使幼虫在水中维持悬浮和升降。俯视观幼虫水平方向为沿顺时针方向运动, 在垂直方向上运动的同时,幼虫则表现为螺旋上升或下降, 该结果与邓正华等[30]观察的珠母贝幼虫运动状态相同。根据Blake等[41]对牡蛎(Crassostrea angulata)幼虫纤毛摆动规律的观察发现, 贝类幼虫面盘外周纤毛的摆动与钟形虫(Vorticella)摆动规律类似, 纤毛周期性按统一方向摆动, 因此在带动面盘产生牵引力的同时也产生一定方向旋转, 从而使幼虫沿着顺时针方向转动。幼虫阶段, 纤毛的摆动使幼虫持续运动并伴随着摄食, Le等[40]认为幼虫在纤毛摆动的同时也形成了水流, 单胞藻随着水流方向运送到幼虫口沟处,部分单胞藻在口沟纤毛摆动下被捕获从而经过幼虫口沟而进入胃, 此种摄食方式摄食效率较低。相比于幼虫的摄食, 稚贝用鳃滤食则大大提高了摄食效率, 随着稚贝的生长, 其鳃丝长及鳃丝数量上的增加大大提高了滤水面积。稚贝鳃丝间距也与其滤食效率有着极其重要的关联, 王芳等[42]认为随着稚贝规格的增大其鳃丝间距的缩小, 贝类滤食过程中饵料从鳃丝间漏掉的机率也就减小, 从而表现为随着稚贝规格的增大其摄食效率也相应提高。在双壳贝类幼虫培育中, 变态期仍然是制约着大多数贝类苗种培育成败的关键[30,31,34]。该实验观察到幼虫变态过程中, 面盘逐渐退化至鳃形成具备滤食功能期间, 其运动方式由水中的悬浮状态转变为沉入水底的爬行, 摄食功能基本丧失, 且鳃形成初期其滤食功能尚不完善。变态期间幼虫不能直接从外源获取营养, 只能依靠原有能量储备来完成生长和变态, 这可能是导致双壳贝类幼虫变态过程中高死亡率的重要原因。由此在幼虫培育过程中, 对其进行营养强化加强幼虫自身能量储备显得尤为必要, 另一方面为幼虫变态提供一个适宜的附着变态条件或药物刺激缩短变态期和减少能量损耗[43]。参考文献：[1]Meng Z H, Zhang B, Liu B S,et al. 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