甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制(4)

目前关于DNA甲基化通过Notch信号通路来调节骨代谢的研究较少。研究表明，Notch1、Notch4基因均存在甲基化，且Delta-like-1基因启动子的超甲基化可调控其表达，当这些配体或受体启动子甲基化水平改变时会激活Notch信号通路，引起下游信号分子HES1上调，进而对骨形成产生影响[31]。此外，Wnt和Notch信号通路并不完全独立，Wnt信号通路中的糖原合成酶激酶3β和Notch通路可相互作用, 通过结合和磷酸化Notch2来调节Notch的活化。Wnt信号通路在成骨调控中其目的基因的表达依赖Runx2的活性，Notch信号通路目的基因HEY1编码的蛋白质可对抗并降低Runx2的转录活性，进而抑制Wnt目的基因的表达，而当Notch1启动子DNA甲基化水平升高时，会导致其表达降低而使NICD释放减少，进而促进Wnt/β-catenin信号通路激活，促进成骨分化[29-30，32]。基于以上分析，作者认为Notch1基因甲基化水平降低时会促进其表达，发挥其对Wnt通路的抑制作用，从而抑制成骨分化；当Notch1基因甲基化水平升高时则会抑制其表达，从而对骨形成产生积极作用，另外，LncRNA在其中也发挥一定作用。

2.2.3 OPG/RANKL/RANK系统与DNA甲基化 OPG/RANKL/RANK系统是调节骨吸收代谢的关键途径分子轴。成骨细胞分泌的RANKL可以激活破骨细胞上的核因子κB受体活化因子 (Receptor activator of nuclear factor kappa B, RANK)并与其结合，在肿瘤坏死因子受体相关因子的参与下激活信号转导，从而促进破骨细胞成熟，增强骨吸收作用，而骨保护素可以抑制RANKL与RANK的结合，降低骨吸收[33]。目前研究表明，肿瘤坏死因子受体相关因子参与OPG/RANKL/RANK系统调节骨代谢的可能途径为：①核转录因子κB途径，首先RANK会与肿瘤坏死因子受体相关因子6结合，激活核转录因子κB诱导激酶并使得核转录因子κB转移至细胞核上调c-Fos的表达，使得破骨细胞生成基因开始转录，并诱导破骨细胞成熟；②JNK途径, RANK与肿瘤坏死因子受体相关因子6结合后激活细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK), 并诱导c-Jun/Fos活化蛋白1(AP-1) 活化, 使c-Jun磷酸化, c-Fox表达增加, 最终使破骨前体细胞功能活跃, 分化生成破骨细胞；③蛋白激酶B (Protein kinase B, PKB, 又称为Akt)途径,RANK与肿瘤坏死因子受体相关因子6结合, 激活磷脂酰肌醇,活化Akt, 参与核转录因子κB活化, 促进破骨细胞成熟[34]。

DNA甲基化可以调控OPG/RANKL/RANK系统影响骨代谢。在对小鼠ST2的骨髓间充质干细胞研究中发现，诱导分化的骨髓间充质干细胞中RANKL基因转录起始位点周围的CPG出现甲基化，导致启动子沉默，抑制了RANKL基因表达，影响成骨细胞分化。进一步实验表明，仅RANKL基因启动子TATA-box上游的单一CpG位点的甲基化就可调节其表达，进而影响破骨细胞分化[35]。DELGADO-CALLE等[36]使用5-氮胞苷处理高甲基化的HEK-293细胞，发现RANKL和骨保护素表达明显上调，而此变化会影响破骨细胞形成，影响骨稳态。另外，DNMT3a能够通过偶联S-腺苷甲硫氨酸介导的代谢途径, 抑制抗破骨细胞形成基因的表达, 调节破骨细胞分化，且此代谢过程涉及RANKL通路相关基因甲基化的改变。虽然HuSAIN等[37]曾表示在人体研究中尚未发现骨质疏松症患者组间RANKL基因的甲基化差异，但WANG等[38]通过分离非骨质疏松/骨质疏松性骨折组织，对骨保护素和RANKL启动子的CPG岛中CPG位点甲基化状态进行检测，结果发现，骨质疏松症组RANKL表达显著高于非骨质疏松症组，而RANKL基因启动子的甲基化水平远远低于非骨质疏松症组。以上分析表明，RANKL基因甲基化水平降低会促进其表达，使OPG/RANKL降低并提高了破骨细胞活性，促进了骨吸收，导致骨流失加速并产生骨质疏松症(图2)。

综上所述，在经典的Wnt/β-catenin、Notch信号通路、OPG/RANKL/RANK系统中，部分受体或配体及下游因子存在 DNA甲 基 化， 如 β-catenin、Frizzled、Notch1、Jag-1、RANKL、以及Runx2、Osx、骨桥蛋白等众多下游基因，这些基因在骨质疏松症体内往往出现甲基化异常，导致骨形成受阻以及骨吸收增加，骨代谢失衡。而除了Wnt/β-catenin与Notch信号通路之间的交互影响外，Notch信号通路中的Notch1也可促进骨保护素表达，进而抑制破骨细胞形成，减少骨吸收[39]。

2.3 DNA甲基化在运动影响骨质疏松症中的作用研究

2.3.1 运动产生的机械效应与骨质疏松症 运动引起的肌肉收缩、血流速度改变、重力变化等宏观负荷可在骨骼内转变为机械刺激[40]，这种刺激是调控骨转换、生长、矿化的关键调节器，合理运动产生的力学刺激能有效地刺激骨的生长。体外研究表明，在细胞水平上，机械负荷通过作用于骨引起骨髓腔产生压力及流动力，从而给间充质干细胞刺激并引起其向成骨分化。前面说过，β-catenin是Wnt信号通路的核心转导因子，研究证实，无论体内、体外机械应力刺激都能促进β-catenin蛋白表达进而激活Wnt信号通路，促进骨形成，并且随着Wnt信号通路的激活，成骨细胞对外源刺激将变得更加敏感[41]。生长期小鼠在经过跑台运动后，相较于未运动组，其内源性甲状旁腺素和雌激素浓度提高，使得LRP5基因和β-catenin蛋白表达上升并导致骨矿含量升高[42]。对小鼠骨髓间充质干细胞施加2%的牵张力干预后，GSK3β活性被抑制，降低了对β-catenin降解作用，使β-catenin大量聚集于细胞质并转移入核，从而激活Wnt信号通路[43]。

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